關鍵詞

SARS-CoV-2；高關注變異株；穩(wěn)定性；消毒效果；人體皮膚；存活時間；感染控制；接觸傳播

 

摘要

我們分析了SARS-CoV-2武漢株系和所有高關注變異株（VOCs）之間的病毒環(huán)境穩(wěn)定性差異。在塑料和皮膚表面，Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株的存活時間比武漢株系長兩倍以上，且在皮膚表面的傳染性持續(xù)超過16小時。這些高關注變異株的高環(huán)境穩(wěn)定性可能會增加接觸傳播的風險，導致進一步病毒擴散。

 

引言

2020年至2021年以來，各種SARS-CoV-2變異株相繼出現。特別是歸類為“高關注變異株”的SARS-eoV-2變異株，會造成重大人員、經濟損失。因此，了解各變異株的特點對感染控制至關重要。據報道，高關注變異株具有較高的傳染性和傳播性（1）。特別是Omicron（Pango譜系：B.1.1.529）變異株的快速傳播，截至2022年已成為全球關注的嚴重問題（2，3）。傳染性/傳播性增加可歸因于多種因素，如感染者散播病毒載量增加、病毒散播期延長、造成感染所需的最低病毒載量降低、感染靶部位改變、環(huán)境穩(wěn)定性增加等(4，5)。

有研究者比較了SARS-CoV-2與SARS-CoV-1、流感病毒等其他病毒的環(huán)境穩(wěn)定性（6，7）。此外，之前的研究還表明，Alpha（Pango譜系：B.1.1.7）和Beta（Pango譜系：B.1.351）變異株具有同等程度的環(huán)境穩(wěn)定性(8，9)。然而，對于包括Omicron和Delta（Pango譜系：B.1.617.2）在內的所有高關注變異株之間的病毒穩(wěn)定性差異，目前尚未有研究進行詳細評價和比較。本研究改進了之前開發(fā)的評價模型，精確分析了武漢株系（Pango譜系：A）與所有高關注變異株在病毒穩(wěn)定性和消毒效果方面的差異。

 

材料與方法 病毒和細胞

本研究中分析的SARS-CoV-2變異株包括武漢株系（Pango譜系：A，hCoV-19/Japan/TY/WK-521/2019）、Alpha變異株（Pango譜系：B.l.1.7，hCoV-19/Japan/QK002/2020）、Beta變異株（Pango譜系：B.1.351，hCoV-19/Japan/TY8-612/2021）、Gamma變異株（Pango譜系：P.l，hCoV-19/Japan/TY7-501/2021）、Delta變異株（Pango譜系：B.l.617.2，hCoV-19/Japan/TYll-927/2021）和Omicron變異株（Pango譜系：B.l.1.529, hCoV-19/Japan/TY38-873/2021）。所有病毒均由日本國立傳染病研究所（National Institute of Infectious Diseases，日本東京）慷慨提供。自日本JCRB細胞保藏中心（Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank，日本大阪）購入表達跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2的VeroE6/TMPRSS2細胞，并將其在添加了5%胎牛血清和G418（Nacalai Tesque，日本京都）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM；Sigma Aldrich）中培養(yǎng)，進行病毒培養(yǎng)與定量(10，11)。按如下步驟進行病毒濃縮和純化：感染后96小時，收獲培養(yǎng)基，并在4℃、2500×g條件下離心10分鐘，消除細胞碎片。使用Beckman SW28轉子，在4℃、27000 rpm條件下，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、20%(w/w)蔗糖墊超速離心2.5小時，沉淀上清液中的病毒粒子（12，13）。在VeroE6/TMPRSS2細胞中以半數組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)測定病毒滴度。接種三天后，在顯微鏡下對各孔細胞病變效應進行評分，并計算TCID50。

 

評價病毒穩(wěn)定性和消毒效果所用皮膚模型的構建

從京都府立醫(yī)科大學法醫(yī)學系獲取的法醫(yī)尸檢標本中采集人體皮膚。將死亡后約1天獲取的20-70歲受試者的腹部皮膚尸檢標本切成尺寸約為4 cm×8 cm的方塊。如受試者皮膚因灼燒或溺水嚴重受損，則不予采集。采用皮膚尸檢標本開發(fā)離體模型，用以評價不同病毒在人體皮膚表面的穩(wěn)定性以及不同消毒劑對人體皮膚表面病毒的消毒效果（6，14）。用PBS清洗去除脂膜的皮膚，將其置于培養(yǎng)池（Corning，美國紐約）中，并放置在孔徑為8.0 μm的膜上。將培養(yǎng)池置于含1.0 mL DMEM（Sigma-Aldrich）的六孔板中。

 

塑料表面和人體皮膚表面病毒穩(wěn)定性評價

對塑料（聚苯乙烯板）表面和人體皮膚（構建的皮膚模型）表面的病毒存活情況進行評價。將病毒溶液（5.0×104 TCID50/2 μL PBS）涂于塑料或人體皮膚表面。每份樣本在受控條件下（25℃，45-55% RH）孵育0-120小時，而后收集表面殘留的病毒于1.0 mL DMEM培養(yǎng)基中并滴定（6）。表面殘留病毒滴度的檢測限為100.5TCID50。病毒存活時間定義為表面無法檢測出病毒的時間。每種條件進行三次獨立實驗。表面殘留病毒滴度結果以平均值±均值標準誤表示。

 

醇基消毒劑消毒效果評價

對不同濃度的醇基消毒劑進行消毒效果評價。對濃度分別為80%、60%、50%、40%、35%、32.5%、30%、27.5%、25%、22.5%和20%（w/w）的乙醇產品（EA，Nacalai Tesque）進行消毒效果檢測。對濃度為70%（w/w）的異丙醇（IPA，Nacalai Tesque）進行檢測。

首先，對消毒劑的消毒效果進行體外評價。將5 μL含病毒的PBS（5.0×104 TCID50/5 μL PBS）在1500 μL的試管中與45 μL各種消毒劑混合15秒。隨后，用450 μL DMEM培養(yǎng)基中和所得溶液，并測定殘留病毒滴度（14）。病毒滴度的檢測限為100.2TCID50。

而后，用已構建的模型評價消毒劑對人體皮膚表面病毒的消毒效果（離體評價）。將每種病毒溶液（1.0×105 TCID50/2 uL PBS）涂于人體皮膚表面。然后將每份皮膚樣本在25℃、45%-55%RH條件下孵育15分鐘，使皮膚表面的病毒混合物完全干燥。隨后，將18 μL消毒劑涂于每份皮膚樣本表面15秒，然后風干5分鐘。干燥后，用1000 μL DMEM回收皮膚表面的殘留病毒，并測定殘留病毒載量（14）。病毒滴度的檢測限為100.5TCID50。為測定每種條件下消毒劑的消毒效果，計算病毒滴度的對數減少值，歸一化為PBS對照滴度。每種條件進行三次獨立實驗，實驗結果以平均值±均值標準誤表示。

 

倫理考量

本研究方案，包括樣本采集程序，已獲得京都府立醫(yī)科大學倫理委員會審核批準（ERB-C-1593），且已獲得所有研究參與者書面知情同意。

 

統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 7（GraphPad,Inc.,La Jolla,CA,USA）進行數據分析。經過的時間定義為解釋變量（X軸），對數病毒滴度定義為被解釋變量（Y軸）。使用對數連結函數進行線性回歸分析，創(chuàng)建回歸曲線。SARS-CoV-2滴度的測定限為100.5 TCID50；因此，病毒的存活時間定義為回歸曲線Y值為0.5時的X值。當表面殘留病毒滴度為2.0和3.0 log10TCID50時，根據每條回歸曲線的斜率計算半衰期(6，12)。

 

結果

測量塑料表面或人體皮膚表面殘留病毒滴度隨時間的變化情況（如補充圖Sl），并通過回歸分析根據這些滴度值計算存活時間和半衰期（如補充圖S2）。在塑料表面分析中，武漢株系、Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron變異株的存活時間分別為56.0小時（95%置信區(qū)間[Cl]，39.0-76.7小時）、191.3小時（95%CI，152.5-232.1小時）、156.6 小時(95%CI，122.7-192.9小時)、59.3小時(95%CI，43.9-77.7小時)、114.0小時（95%CI，91.3-139.1小時）和193.5小時(95%CI，153.1-236.2小時)（如圖lA和補充表S1所示）。在人體皮膚表面分析中，武漢株系、Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron變異株的存活時間分別為8.6小時（95%Cl，6.5-10.9小時）、19.6小時（95%CI，14.8-25.3小時）、19.1小時(95%CI，13.9-25.3小時)、11.0小時(95%CI，8.1-14.7小時)、16.8小時（95%CI，13.1-21.1小時）和21.1小時(95%CI，15.8-27.6小時)（如圖lB和補充表S1所示）。Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株的存活時間顯著長于武漢株系；Omicron變異株的存活時間最長。此外，半衰期顯示出與存活時間相同的趨勢（如圖1C、1D和補充表S2所示）。

體外消毒效果評價顯示，武漢株系和Gamma變異株在32.5%EA作用下15秒內完全滅活（對數減少值＞4），Alpha、Beta和Delta變異株在35%EA作用下15秒內完全滅活，Omicron變異株在40%EA作用下15秒內完全滅活（如圖2A和補充表S3所示）。因此，Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株對乙醇的抗性略高于武漢株系。然而，在人體皮膚表面進行的離體評價顯示，所有病毒均在暴露于35%EA中15秒后實現完全滅活（對數減少值＞4；如圖2B和補充表S4所示）。

 

討論

2020年，有多項研究(6，7，15)報告了武漢株系的環(huán)境穩(wěn)定性。此外，一些研究表明，Alpha和Beta變異株具有同等程度的環(huán)境穩(wěn)定性(8，9)。然而，尚無研究直接比較其他高關注變異株與武漢株系，武漢株系與所有高關注變異株（包括Omicron和Delta 變異株）在環(huán)境穩(wěn)定性方面的差異尚未可知。

本研究顯示，在塑料和皮膚表面，Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株的存活時間比武漢株系長兩倍以上，且在皮膚表面的傳染性持續(xù)超過16小時。這些高關注變異株的高環(huán)境穩(wěn)定性可能會增加接觸傳播的風險，導致高關注變異株進一步擴散。此外，該分析還顯示，Alpha和Beta變異株在存活時間方面無顯著差異，環(huán)境穩(wěn)定性相似，這一結果與之前的研究結果一致(8,9)。

隨著全球感染人數的迅速增加，Omicron變異株成為目前人們主要關注的問題。Omicron變異株傳播迅速，其潛在因素可能在于感染靶部位從下呼吸道轉移至上呼吸道以及該變異株的中和抗體逃逸機制(1-5)。本研究表明，在諸多高關注變異株中，Omicron變異株的環(huán)境穩(wěn)定性最高，這表明，這種高穩(wěn)定性也可能是導致Omicron變異株取代Delta變異株并迅速傳播的原因之一。???

盡管Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株在環(huán)境穩(wěn)定性增加的情況下乙醇抗性也略微增加，但皮膚表面所有高關注變異株均可在暴露于35%EA中15秒后完全失活。因此，按照世界衛(wèi)生組織的提議，強烈建議使用具有適當EA濃度的消毒劑（＞52 w/w%或＞60 v/v%）作為當前的感染控制（手部衛(wèi)生）手段（16，17）。

本研究存在三個局限性。首先，現階段尚不知曉Alpha、Beta、Delta和Omicron變異株環(huán)境穩(wěn)定性較高的原因所在，使用重組病毒進行評價可能能夠找出決定這一點的各項因素。其次，此次環(huán)境穩(wěn)定性評價中獲得的存活時間和半衰期可能受外部環(huán)境和含病毒體液組成變化的影響。本研究為準確分析各高關注變異株之間的穩(wěn)定性差異，采用了超速離心法純化靶病毒，并以PBS作為溶劑。第三，現階段尚不明確表面殘留病毒量與傳播風險之間的關系。因此，將本研究中的存活時間值理解為一項參考值可能更為合理。

綜上所述，本研究闡明了各高關注變異株的環(huán)境穩(wěn)定性，為感染控制提供了重要參考信息。此外，結合遺傳分析，這些研究結果將有助于闡明高關注變異株的傳播機制。

圖1病毒在塑料和皮膚表面的存活時間和半衰期（A、C）

各種病毒在塑料表面的存活時間（A）和半衰期（C）(B、D)各種病毒在人體皮膚表面的存活時間（B）和半衰期（D）存活時間指表面無法檢測出病毒的時間。圖中所有半衰期均指皮膚表面殘留1×102或1×103TCID50（半數組織培養(yǎng)感染劑量）病毒時的半衰期。數據以中位數±95%置信區(qū)間表示。

圖2.消毒效果評價研究進行了體外評價（A）和離體評價（B），并根據每次醇基消毒劑暴露后的殘留病毒滴度計算對數減少值（見補充表S3和S4）。結果以平均值±標準誤表示。EA，乙醇；IPA，異丙醇。

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